本文由馬爾文帕納科應(yīng)用專家周紫微、李航偉供稿
擴(kuò)散屏障法簡(jiǎn)介
開發(fā)基于蛋白質(zhì)的產(chǎn)品需要了解它們?cè)谌芤褐械谋憩F(xiàn),而測(cè)量樣品的Zeta電位可通過預(yù)測(cè)聚集行為,研究蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性。但在實(shí)際測(cè)量過程中,Zeta電位明顯變化并不是電場(chǎng)本身導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的聚集,其變化的真正原因是蛋白質(zhì)與電極的接觸導(dǎo)致。
本文將介紹一種新的方法:擴(kuò)散屏障法,可以提高測(cè)量樣品Zeta電位時(shí)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。
擴(kuò)散屏障法通過引入一個(gè)較小的樣品量,用溶解蛋白質(zhì)的相同緩沖液將樣品與電極分離,因此電極對(duì)蛋白質(zhì)的影響大大降低。由于這種保護(hù)僅由樣品與電極的距離提供,在樣品擴(kuò)散到電極之前,樣品都不會(huì)受其影響。而這一過程可能需要數(shù)小時(shí),因?yàn)橹粶y(cè)量了可溶性天然蛋白的遷移率,使得樣品的測(cè)量結(jié)果更加可靠。
測(cè)量過程
一、樣品裝載
首先將溶解蛋白質(zhì)的緩沖液注入折疊毛細(xì)管樣品池中。然后將樣品池放入Zetasizer納米粒度電位儀中靜置2至3分鐘,使其溫度達(dá)到平衡。這將減少任何與溫度有關(guān)的流體運(yùn)動(dòng),如對(duì)流。然后取出樣品池,通過圖1所示的槍頭將20~100 μL的樣品直接注入毛細(xì)管樣品池的最底部(圖2)。
圖 1 200μl的凝膠上樣移液槍頭
圖2 折疊毛細(xì)管孔中的凝膠移液槍頭,用于裝載擴(kuò)散屏障方法的樣品量
圖3 裝樣對(duì)比圖:在10 mM NaCl中充滿藍(lán)色葡聚糖的樣品池(左);樣品池填充10 mM NaCl,并加入50 μl藍(lán)色葡聚糖作為擴(kuò)散屏障(右)
很明顯,樣品的藍(lán)色部分位于樣品池的測(cè)量體積中,距離樣品池頂部的電極有相當(dāng)大的距離。如果樣品池保持直立并小心處理,樣品將不會(huì)在樣品池內(nèi)部擴(kuò)散。在開始測(cè)量之前,應(yīng)使溫度達(dá)到平衡。
二、遷移率測(cè)量
理論上,使用擴(kuò)散屏障法進(jìn)行遷移率測(cè)量與在Zetasizer Nano中進(jìn)行常規(guī)測(cè)量相同。在實(shí)際測(cè)樣過程中,離子強(qiáng)度較高的緩沖液會(huì)有較高的電導(dǎo)率,導(dǎo)致在給定電壓下焦耳加熱增加。需要進(jìn)行一些手動(dòng)改進(jìn),以提高使用擴(kuò)散屏障法進(jìn)行測(cè)量的數(shù)據(jù)質(zhì)量。
為了避免顯著的焦耳熱,應(yīng)根據(jù)所使用的緩沖液的導(dǎo)電性來選擇電壓。如表1所示,在軟件中自動(dòng)選擇適當(dāng)?shù)碾妷海S著緩沖鹽的濃度增加,所用的電壓降低,并且運(yùn)行次數(shù)最多為20次,以盡量減少焦耳熱。建議在兩次測(cè)量之間設(shè)置180秒的延遲,這也是為了確保測(cè)量之間的溫度平衡。
表1:給定濃度緩沖液的建議電壓和最大運(yùn)行次數(shù)
Zetasizer軟件版本7及以上的蛋白質(zhì)遷移率測(cè)量類型將使所有這些設(shè)置自動(dòng)化,使測(cè)量盡可能簡(jiǎn)單。
評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量
一,粒徑分布變化
建議在zeta電位測(cè)量之前和之后都進(jìn)行粒徑測(cè)量,以檢查樣品是否因電位測(cè)量而發(fā)生變化。如果遷移率測(cè)量影響了樣品并導(dǎo)致其聚集,這些聚集應(yīng)該出現(xiàn)在遷移率測(cè)量后的尺寸測(cè)量數(shù)據(jù)中。圖4A顯示了在任何遷移率測(cè)量之前的粒徑測(cè)量示例。該樣本不含聚集體,PDI為0.05。在常規(guī)的zeta電位測(cè)量后,聚集體已經(jīng)形成,PDI接近0.2(圖4B)。然而,當(dāng)采用擴(kuò)散屏障法時(shí),沒有形成聚集體,遷移率測(cè)量后的PDI仍然低于0.05(圖4C)。
圖4A 樣品遷移率測(cè)量前的粒徑分布
圖4B 樣品常規(guī)遷移率測(cè)量后的粒徑分布
圖4C 使用擴(kuò)散屏障法測(cè)量遷移率后的粒徑分布
二、頻率分布的對(duì)比
樣品中的聚集體將具有較低的布朗運(yùn)動(dòng)速度,從而在頻率圖中產(chǎn)生一個(gè)尖銳的峰值。因此,頻率圖中出現(xiàn)寬峰是識(shí)別高質(zhì)量數(shù)據(jù)的好方法。
圖5顯示了蛋白質(zhì)遷移率測(cè)量的兩個(gè)頻率圖。圖5A顯示了使用擴(kuò)散屏障法重復(fù)測(cè)量的頻率寬峰,連續(xù)測(cè)量的圖重疊良好,表明沒有聚集物存在。圖5B顯示了未使用擴(kuò)散屏障法的連續(xù)測(cè)量疊加圖。第一個(gè)測(cè)量是紅線,它顯示了廣泛的分布和良好的測(cè)量。然而,隨著測(cè)量的進(jìn)行,由綠藍(lán)線和黑線表示,很明顯,一個(gè)大而尖銳的峰正在形成,這代表了在測(cè)量過程中聚集的樣品。多次測(cè)量的圖不一致,因此無法獲得可重復(fù)的遷移率測(cè)量。
圖5A 使用擴(kuò)散屏障法進(jìn)行的連續(xù)測(cè)量的頻率圖
圖5B:常規(guī)遷移率測(cè)量的頻率圖
焦耳熱是測(cè)量重復(fù)性下降的原因之一,而通過電導(dǎo)率的測(cè)量可以有效識(shí)別焦耳熱。為了盡量減少焦耳熱的影響,電導(dǎo)率應(yīng)限制在連續(xù)測(cè)量之間的增加不超過5-10%。如果它的增加超過這個(gè)值,則表明已經(jīng)發(fā)生了明顯的加熱,這可能會(huì)影響樣品并降低測(cè)量的可重復(fù)性。
至少要進(jìn)行5次測(cè)量,以確保數(shù)據(jù)是可重復(fù)的。在方法開發(fā)過程中,建議測(cè)試一種廉價(jià)的替代蛋白質(zhì),以優(yōu)化方法。
結(jié)
論
Conclusion
通過應(yīng)用擴(kuò)散屏障法,可以有效消除在使用電泳光散射法進(jìn)行Zeta電位測(cè)量時(shí)蛋白質(zhì)樣品和電極的相互作用造成的聚集。通過最小化樣品體積并將蛋白質(zhì)與電極分離,這種新方法是一種簡(jiǎn)單、強(qiáng)大的解決方案,可以在不損害蛋白質(zhì)本身的情況下對(duì)蛋白質(zhì)的遷移率進(jìn)行高度可重復(fù)的測(cè)量。
Zetasizer Advance 系列
DLS & ELS 技術(shù)
Zetasizer Advance 系列納米粒度電位分析儀可用于納米顆粒粒徑和穩(wěn)定性分析。
DLS動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)
納米顆粒大小,Zeta電位及顆粒濃度
粒度測(cè)量范圍:0.3nm-15μm
Zeta電位范圍:3.8nm-100μm